单核细胞增生李斯特菌特异性单链抗体磁珠的制备与评价（二）

1.4法兰克福香肠人工污染单核细胞增生李斯特菌

取同批号待检法兰克福香肠6～7袋，单核搓揉外包装，细胞性单使内容物与液体充分接触。增生珠的制备无菌开启包装，李斯链抗取浸出液40mL（每袋约6mL），特菌特异体磁混匀，单核作为待测样，细胞性单置4℃保存。增生珠的制备人工污染前，李斯链抗取1mL浸出液通过增菌培养法检测待测样。特菌特异体磁选择未受李斯特菌属污染的单核待测样，接种新鲜培养的细胞性单单核细胞增生李斯特菌（AＴCC19115），使其终浓度约为＜1CFU/mL、增生珠的制备1CFU/mL、李斯链抗10CFU/mL和100CFU/mL。特菌特异体磁污染后将样品置4℃稳定24h，模拟食用前的微生物存活状态。

1.5法兰克福香肠人工污染单核细胞增生李斯特菌和英诺克李斯特菌

取40mL待测样，分别接种新鲜培养的单核细胞增生李斯特菌AＴCC19115（LM）和英诺克李斯特菌AＴCC51742（LI）。菌液终浓度LM/LI的比例分别为1/1，1/10，1/100，1/1000，10/10，10/100，10/1000，100/10，100/100和100/1000。污染后将样品置4℃稳定24h。

1.6目标菌的磁珠捕获与菌落计数

1.6.1 BHI培养基中磁珠的捕获效率

分别将3株单核细胞增生李斯特菌和6株其它李斯特菌属细菌接种至BHI培养基中培养（表3），制成约105CFU/mL菌液。取上述菌液1mL，分别加入20μL免疫磁珠溶液，4℃轻微振荡1h。用PBS缓冲液在磁力架上清洗3次，用1mL相同的缓冲液重悬，必要时进行10倍系列稀释。以6×6滴板计数法（每滴10μL）在BHI琼脂培养基上计数，比较磁珠捕获前后微生物的数量变化。

1.6.2法兰克福香肠中单核细胞增生李斯特菌的检测

以USDA-FSIS检测方法为基础（MicrobiologyLaboratoryGuidebook，MLG8.1），结合磁珠捕获和PCR确认技术，检测法兰克福香肠中的单核细胞增生李斯特菌。取第1次增菌的UＶM培养基（Modifieduniversityofvermontbroth）90mL，加入10mL人工污染浸出液，置（30±2）℃振荡160r/min培养（22±2）h。分别取0.1mLUＶM培养物至第2次增菌的10mLFB培养基（Fraserbroth）和10mLMOPS-BLEB培养基（Morpholinepropanesulfonicacidbufferedlisteriaenrichmentbroth）中，置（35±2）℃振荡250r/min培养（26±2）h。取上述UＶM、FB和MOPS-BLEB培养物各1mL，分别加入scFv-IMBs和Dyna-IMBs溶液20μL，按1.6.1节的方法分别在BHI琼脂和显色琼脂上计数。剩余的磁珠捕获液用于显色培养基划线和细菌基因组DNA提取。

2结果

2.1BHl培养基中磁珠的捕获效率

采用9株细菌考察BHI培养基中两种磁珠的特异性。scFv-IMBs对3株单核细胞增生李斯特菌的捕获率在15%～55%之间，高于同种培养基中Dyna-IMBs的0.85%～1.27%捕获率。scFvIMBs除对斯氏李斯特菌和伊氏李斯特菌的捕获率略高于Dyna-IMBs外，对李斯特菌属中非单核细胞增生李斯特菌的捕获率均低于0.61%。在BHI纯培养系统中，scFv-IMBs显示出良好的特异性和较高的捕获率。

2.2备选PCR引物的验证

为了从5种备选的引物中选择出单核细胞增生李斯特菌特异性PCR检测引物，针对23株待测微生物进行PCR引物验证。引物Lmo0733具有李斯特菌属水平特异性；格式李斯特菌干扰引物Aznar的检测；威尔斯李斯特菌、格式李斯特菌和部分英诺克李斯特菌干扰引物Ｊaton的检测。经试验确认的单核细胞增生李斯特菌种水平的特异性为引物Fluit和Nied（表1），这两对引物目标靶点是对李斯特菌溶血素O基因（hlyA）。由于引物Nied在51℃退火时具有较高的检测灵敏度，可检测到约2.86pg的单核细胞增生李斯特菌基因组（数据未列出），被用于后续试验的PCR检测中。

2.3法兰克福香肠中单核细胞增生李斯特菌的检测

在BHI和显色培养基上计数的菌落数（或典型菌落数）分别代表了样品经UＶM、FB或MOPS-BLEB培养基培养后，所有微生物的总数和单核细胞增生李斯特菌的数量。法兰克福香肠浸出液经增菌培养后，背景菌的浓度可达到10⁷～10⁸CFU/mL，而单核细胞增生李斯特菌的浓度约为10²～10⁴CFU/mL，背景菌在培养物中占据主导地位（表4）。由于高浓度背景微生物影响磁珠与目标微生物的结合，导致在第一步UＶM培养基中两种磁珠的捕获率均低于5%，甚至无法在琼脂平板上分离获得目标菌。经FB和MOPS-BLEB培养基二次增菌后，单核细胞增生李斯特菌的比例由第1次增菌前不足0.01%（浓度小于10⁴CFU/mL）迅速提升到20%～80%（浓度约为10⁶～10⁸CFU/mL），而背景菌的数量未见显著增加（表4）。其中，经MOPS-BLEB培养后李斯特菌属细菌的终浓度会高于FB培养基，并成为体系内优势菌，具有较好的选择培养性。

采用scFv-IMBs和Dyna-IMBs两种磁珠捕获后，通过显色培养基和PCR检测证实，磁珠捕获方法对单核细胞增生李斯特菌的灵敏度可达1CFU/mL。两种磁珠在MOPS-BLEB培养基中的捕获率（62%～88%）明显高于UＶM培养基（＜5%）和FB培养基（＜53%）中的捕获率。

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